Inżynier i Fizyk Medyczny 2/2017 vol. 6
121
fizyka medyczna
/
medical physics
artykuł naukowy
/
scientific paper
Etap II – Przygotowanie próbek surowicy
do pomiarów
1
H NMR
Przygotowanie próbek surowicy NMR wymaga – w najbardziej
minimalistycznym zakresie – rozcieńczenia surowicy poprzez
dodatek wody (H
2
O) i wody deuterowanej (D
2
O). Często stoso-
wane jest również dostosowanie kwasowości poprzez dodanie
buforu. Przygotowywanie rozpuszczalnika może odbywać się
zgodnie z procedurą opisaną przez Beckonerta i współautorów
[30] lub w oparciu o przepis rekomendowany przez firmę Bruker.
Nasze testy porównawcze wykazały, że rozpuszczalnik zawierają-
cy bufor fosforanowy zwiększa stabilność próbek surowicy [16].
Aby uzyskać 500 ml rozpuszczalnika z buforem, w 380 ml
wody rozpuszczane są następujące składniki:
o
0,4 g wzorca wewnętrznego TSP-d
4
(TSP, sól sodowa kwasu
2,2,3,3-tetradeutero-3-(trimetylosililo)propanowego),
o
10,05 g Na
2
HPO
4
∙ 7H
2
O (siedmiowodny hydrat wodorofos-
foran sodu)
o
5 ml NaN
3
(4%) (azydek sodu).
Następnie pH roztworu doprowadzane jest do wartości 7,4 ±
0,2 przy użyciu 1MNaOH (wodorotlenek sodu) lub HCl (kwas sol-
ny). Powstały roztwór jest uzupełniany dodatkiem H
2
O do 400
ml i dodatkiem 100 ml D
2
O.
Przed rozpoczęciem pomiarów surowicę należy rozmrozić,
a następnie zworteksować, aby nie dochodziło do rozdzielenia
fazy wodnej.
Roztwór pomiarowy powstaje ze zmieszania 500 μl surowicy
z 500 μl rozpuszczalnika. 600 μl przygotowanego roztworu jest
przenoszone do probówki NMR. Przygotowane próbki są prze-
chowywane w temperaturze 4
°
C aż do analizy NMR (w czasie nie
dłuższym niż 8 godzin).
Dzięki zastosowaniu buforu, próbki surowicy mają
niemal identyczne wartości pH – umożliwia to porów-
nywanie wartości przesunięć chemicznych sygnałów
w widmach protonowych
1
H NMR. Przygotowane
próbki mają też identyczną objętość, aby zachować
stałą jakość rejestracji widm, oraz identyczne stęże-
nia, aby można było porównywać szerokości połów-
kowe sygnałów [34].
Rejestracja widm NMR
Utrzymanie rygorów jakościowych widm wymaga po-
przedzaniapomiarówrutynowychcodziennymitestami
kontroli jakości. Testy prowadzone są w temperaturze
300 K przy użyciu próbki wzorcowej, zawierającej 2 mM
sacharozy, 0,5 mM DSS (sól sodowa kwasu 2,2-dimety-
lo-2-silapentano-5-sulfonowego), 2mMNaN
3
, 10%D
2
O
oraz 90% H
2
O. Zgodnie z parametrami akceptacyjnymi,
szerokość połówkowa sygnału przy 0 ppm – pochodzą-
cego od atomów wodoru grup metylowych DSS – nie
powinna przekraczać 0,7 Hz. Na tej samej próbce prze-
prowadza się także test tłumienia sygnału wody.
Aby poszerzyć zakres informacji spektralnych uzyskiwanych
z badanej próbki, w pomiarach metabolomicznych stosuje się
zazwyczaj kilka sekwencji impulsowych, stanowiących odrębne
„okna spektralne” dla związków chemicznych istotnie różniących
się pod względem fizykochemicznym (różne masy cząsteczkowe,
różne czasy relaksacji). Dzięki takiej filtracji zachodzącej na pozio-
mie rejestracji widm NMR możliwa jest osobna analiza związków
niskocząsteczkowych oraz makrocząsteczek (głównie lipidów)
[30], co jest szczególnie cenne w przypadku tak złożonych ukła-
dów, jakimi są próbki biologiczne. W pomiarach metabolomicz-
nych zalecane jest wykonanieminimum czterech eksperymentów
z wykorzystaniem następujących sekwencji impulsowych:
o
1D NOESY (
Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
) – ta jed-
nowymiarowa sekwencja impulsowa umożliwia zaprezen-
towanie na jednym widmie molekuł zarówno o niskiej, jak
i wysokiej masie cząsteczkowej.
o
CPMG (
Carr–Purcell–Meiboom–Gill
) – na tego typu widmach
pojawiają się tylko sygnały pochodzące od grup funkcyj-
nych metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej.
o
DIFF (
Diffusion edited
) – ta sekwencja impulsowa służy do
wykrywania sygnałów makrocząsteczek.
o
2D JRES (
J-resolved
) – to dwuwymiarowa sekwencja, która wi-
zualizuje stałe sprzężenia skalarnego. Wwersji 2Dułatwia ona
identyfikowanie metabolitów, natomiast jednowymiarowa
projekcja 1D widm JRES ułatwia detekcję zmian profilu meta-
bolicznego. Widma 1D JRES zawierają sygnały pochodzące od
metabolitówniskocząsteczkowych (podobnie jak CPMG), lecz
ze względu na homoodsprzęganie są one singletami, a nie
multipletami, jak na widmach CPMG. Projekcja taka jest więc
łatwiejsza do analizy i określania ilościowego metabolitów.
Rys. 1
Widma
1
H NMR surowicy krwi zarejestrowane na spektrometrze Bruker Avance III 400,13 MHz w temperaturze 310
K przy użyciu następujących sekwencji impulsowych: (a) NOESY, (b) CPMG, (c) DIFF i (d) JRES (1D)
Źródło: Archiwum własne.
