vol. 6 2/2017 Inżynier i Fizyk Medyczny
122
fizyka medyczna
\
medical physics
artykuł naukowy
\
scientific paper
Identyfikacja sygnałów na widmach NMR prowadzona jest
zazwyczaj w oparciu o komercyjne bazy metabolitów, takie jak
Chenomx
/), oraz bazy otwarte, jak
np. baza dostępna pod adresem
/.
Przykładowe widma surowicy krwi zarejestrowane przy uży-
ciu wymienionych wcześniej sekwencji impulsowych i zidentyfi-
kowane przy użyciu baz Chenomx i HMDB przedstawione zosta-
ły na rysunkach 1 i 2.
Czynniki wpływające na jakość widm
1
H NMR
Podstawowym wyzwaniem w metabolomicznych ilościowych
pomiarach NMR stanowią kwestie jakości danych spektralnych
i powtarzalności pomiarowej. Nawet pozornie mało istotne
operacje przeprowadzane przy rejestracji widm, jak na przykład
sposób wprowadzania próbek do magnesu, stosowane proto-
koły optymalizacji pola magnetycznego, wybór stosowanych
sekwencji impulsowych stanowią ważne źródła zmienności,
które mogą utrudnić identyfikację metabolitów i oznaczenia ilo-
ściowe [35]. Także dobór parametrów akwizycji danych, parame-
trów obróbki widm oraz wybór metody tłumienia wody mogą
również znacząco wpłynąć na jakość danych spektralnych [36].
Stosowane sekwencje impulsowemogą byćmodyfikowane i do-
stosowywane do konkretnego problemu badawczego, jednak po-
miary metabolomiczne wymagają stosowania się do identycznych
reżimów pomiarowych przy przechodzeniu od próbki do próbki.
Pośród wielu parametrów sekwencji, które wpływają na ja-
kość widm protonowych
1
H NMR [16, 30], niektóre wymagają
szczególnej uwagi:
•
Liczba punktów domeny czasowej – biorąc pod uwagę roz-
miar okna widmowego i żądaną rozdzielczość badania, po-
miar NMR, który ma zostać wykorzystany w analizie meta-
bolomicznej powinien zawierać co najmniej 32 K punktów.
magnetycznego, parametrów sprzętowych (np. typ głowi-
cy pomiarowej), jakości i stężenia próbki, temperatury po-
miaru, kąta odchylenia magnetyzacji (
Flip Angle
).
•
Czułość odbiornika RG (
Receiver Gain
) – parametr ten jest czę-
stowybieranywcelu zmaksymalizowania stosunku sygnału do
szumu. Pomiar NMR może przebiegać w dwóch trybach: przy
stałym ustawieniu wzmocnienia odbiornika (zoptymalizowa-
nymdo standardowej próbki) lub z automatycznieoptymalizo-
wanymwzmocnieniemodbiornika dla każdej próbki.Wpomia-
rach metabolomicznych zalecany jest tryb zoptymalizowany
względem próbki wzorcowej, stały RG dla wszystkich bada-
nych próbek – tryb ten pozwala na bezpośrednie porównywa-
nie intensywności odpowiednich sygnałów różnych próbek.
•
Tłumienie sygnału wody – wytłumienie sygnału wody (pre-
saturacja) jest konieczne w przypadku próbek surowicy
krwi, bowiem woda jest podstawowym składnikiem suro-
wicy i zdominowałaby widmo. Sygnał wody (przy 4,7 ppm)
powinien być wytłumiony do poziomu porównywalnego
lub niewiele wyższego od najwyższych sygnałów metabo-
litów. W piśmiennictwie można spotkać się z zaleceniami,
aby parametr wytłumienia sygnału wody ustawiać tylko
dla pierwszej mierzonej próbki, a w pomiarach kolejnych
próbek korzystać z uzyskanych ustawień [30]. Jednak z na-
szych doświadczeń wynika, że parametr presaturacji powi-
nien być ustawiany indywidualnie dla każdej próbki, przed
rozpoczęciem akwizycji jej widm
1
H NMR.
•
Temperatura pomiaru – w pomiarach metabolomicz-
nych konieczne jest utrzymywanie stałej temperatury we
wszystkich pomiarach. Tylko przy spełnieniu tego warunku
wartości przesunięć chemicznych sygnałów w widmach
protonowych
1
H NMR są porównywalne. W przypadku su-
rowicy zaleca się temperaturę 310 K [16], co odpowiada
ludzkiej temperaturze ciała.
Rys. 2
Widmo
1
H NMR surowicy krwi zarejestrowane na spektrometrze Bruker Avance III 400,13 MHz w temperaturze 310
Kprzyużyciusekwencji impulsowejJRES(2D).Skalaf1prezentujestałesprzężenia,askalaf2 jestskaląprzesunięćchemicznych
Źródło: Archiwum własne.
•
Czas repetycji – jest to czas potrzebny na rejestrację
pojedynczego skanu widma. Parametr ten wpływa
na intensywności integralne sygnałów, a więc na
oznaczenia ilościowe metabolitów. W pomiarach
ilościowych czas repetycji powinien być pięć razy
dłuższy niż najdłuższy z czasów relaksacji podłużnej
T1 jąder w próbce, co nie zawsze jest możliwe, szcze-
gólnie w próbkach wymagających stasowania dużej
liczby powtórzeń przy rejestracji widm. W takim
przypadku stosowana jest korekta relaksacyjna lub
porównanie z widmem zarejestrowanym w warun-
kach pełnej relaksacji przy wykorzystaniu specjali-
stycznego oprogramowania, np. Chenomx lubAMIX.
•
Liczba powtórzeń sekwencji (inaczej: liczba ska-
nów lub akwizycji) – liczba ta wpływa na stosu-
nek sygnału do szumu SNR (
Signal to Noise Ratio
).
W analizie ilościowej znajdują zastosowanie tylko
widma NMR o wysokiej wartości parametru SNR.
SNR zależy od liczby powtórzeń, ale też od wielu
innych czynników, między innymi: natężenia pola
