vol. 6 2/2017 Inżynier i Fizyk Medyczny
120
fizyka medyczna
\
medical physics
artykuł naukowy
\
scientific paper
Wśród narzędzi badawczychmetabolomiki, dziedziny biologii sys-
temowej zajmującej się analizą jakościową i ilościową metaboli-
tów obecnych w danym układzie biologicznym, centralną pozycję
zajmują spektrometria masowa MS (
Mass Spectrometry
), zazwy-
czaj skojarzona z technikami chromatograficznymi, oraz spek-
troskopia magnetycznego rezonansu jądrowego wysokiej roz-
dzielczości HR NMR (
High Resolution Nuclear Magnetic Resonance
).
Techniki NMR są szczególnie skuteczne w detekcji i identyfikacji
związków chemicznych występujących w stężeniach milimolo-
wych [3, 4]. Chociaż spektrometria masowa przewyższa techniki
NMR pod względem liczby identyfikowanych związków, to jednak
zalety metabolomiki wspartej na technikach NMR są ogromne.
Wśród nich należy wymienić prostotę przygotowania próbki,
możliwość jednoczesnego pomiaru wielu związków chemicznych
oraz ich identyfikacji ilościowej i jakościowej, niedestrukcyjny dla
próbki pomiar, możliwość automatyzacji rejestracji widm, szyb-
kość, powtarzalność i niski koszt pomiarów [5, 6]. Zalety te spra-
wiają, że HR NMR może już wkrótce znaleźć swoje stałe miejsce
wśród technik analitycznych stosowanych w medycynie.
Materiał biologiczny wykorzystywany w pomiarach NMR to
ekstrakty komórkowe i tkankowe oraz płyny ustrojowe (np. krew
pełna, osocze, surowica, mocz, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy)
– do ich badania stosowane są techniki cieczowe [7-10], ale także
wycinki tkankowe i materiały biopsyjne – w tym przypadku uży-
teczna jest technika NMR z rotacją pod kątem magicznym, MAS
NMR (
Magic Angle Spinning NMR
) [11].
Osocze krwi i jej surowica to najczęściej stosowane w bada-
niach biologicznych i klinicznych płyny ustrojowe. Są one dostęp-
ne praktycznie nieinwazyjnie, a ich skład metaboliczny odzwier-
ciedla reakcje systemowe organizmu na czynniki środowiskowe
[12], chorobę oraz terapię [13-15]. Tymsamym, umożliwiającwgląd
w stan metaboliczny ustroju w momencie pobierania próbek,
spektroskopia NMR pozwala identyfikować biomarkery – kon-
kretne metabolity lub ich zestaw – badanych procesów.
Ludzki metabolom surowicy krwi jest dostępny w postaci
otwartej bazy danych (
/)
[1, 2]. Aktualnie zawiera ona kilka tysięcy związków, które kiedy-
kolwiek zostały wykryte i określone ilościowo z wykorzystaniem
różnych technik analitycznych, w tym także technik NMR [2].
Coraz częściej metabolomika wsparta na technikach HR NMR
znajduje zastosowanie w onkologii [16-22] oraz w innych dziedzi-
nach medycyny [23-29]. Włączenie jej do procesu diagnostycz-
nego i monitorowania terapii stanowi niewątpliwie krok w kie-
runku personalizacji leczenia [16].
Celem tej pracy jest przedstawienie specyfiki przygotowania
próbek surowicy krwi do metabolomicznych pomiarów spektro-
skopowych. Opisano tu także podstawowe sekwencje impulso-
we NMR, które są użyteczne w badaniach metabolomicznych.
Składniki krwi
Krew jest płynną mieszaniną osocza i elementów upostaciowio-
nych (erytrocyty, trombocyty, leukocyty itp.). Osocze stanowi
ok. 55% objętości krwi, a w jego skład wchodzą woda (ok. 90%),
białka (albuminy, globuliny – ok. 7%) oraz związki organiczne
i nieorganiczne (m.in. kwasy tłuszczowe, cholesterol, triglice-
rydy, hormony, glukoza, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach
(A, D, E, K), dwutlenek węgla, produkty metabolizmu białek
(mocznik, aminokwasy), produkty metabolizmu hemu (biliru-
bina oraz urobilinogen), sole mineralne (ok. 3%). Osocze, płyn
słomkowej barwy, uzyskuje się przez wirowanie próbki krwi.
Surowica krwi (łac.
serum
) to część osocza krwi pozbawiona fi-
brynogenu, która w przeciwieństwie do osocza nie krzepnie [2].
Przygotowanie surowicy krwi
do badań metabolomicznych
Podstawowym celem metabolomicznej analizy płynów ustrojo-
wych i tkanek technikami NMR jest identyfikacja potencjalnych
biomarkerów – nowych elementów profilu metabolicznego lub
zmian w profilu metabolicznym charakterystycznych dla proce-
su patologicznego lub mających związek z procesem leczenia.
Zaobserwowane różnice powinny być biologicznie i statystycz-
nie istotne. To wyzwanie nakłada wysokie wymagania na cały
proces pomiarowy, w tym na oba etapy przygotowania próbek:
bankowanie surowicy i przygotowanie jej do badań NMR muszą
odbywać się zgodnie z jednolitym dla wszystkich próbek proto-
kołem laboratoryjnym.
Etap I – Bankowanie surowicy
Prawidłowe pozyskanie i przechowywanie surowicy krwi ma
kluczowe znaczenie dla jakości pomiaru NMR i analizy metabo-
lomicznej. Brak respektowania ujednoliconych dla wszystkich
próbek procedur pobierania, przetwarzania czy przechowywa-
nia próbek może generować błąd systematyczny, który z kolei
obniży wartość informacyjną uzyskanych danych spektroskopo-
wych [30].
Prawidłowo zabankowana próbka powinna zostać umieszczo-
na w temperaturze - 80
o
C natychmiast po pobraniu i przetwo-
rzeniu. Zamrożenie surowicy krwi w tej temperaturze znacząco
wydłuża czas jej przechowywania, nawet do kilku lat [31]. Licz-
ba cykli zamrażania i rozmrażania powinna być zminimalizowa-
na, bowiem wielokrotne powtarzanie tego cyklu ma mierzalny
wpływ na stężenia metabolitów [32].
Ważne jest, aby rozmrażanie surowicy również odbywało się
zawsze w ten sam sposób. W laboratoriach stosowane są róż-
ne metody rozmrażania, na przykład rozmrażanie w tempera-
turze pokojowej, na suchym lodzie czy rozmrażanie stopniowe
(najpierw w temperaturze 4
°
C, a następnie w temperaturze po-
kojowej). Rozmrażanie stopniowe jest zalecane ze względu na
stosunkowo krótki czas rozmrażania (w porównaniu z rozmraża-
niem na suchym lodzie) oraz mniejszy wpływ na stabilność pró-
bek surowicy niż rozmrażanie w temperaturze pokojowej, które
jest często stosowane ze względu na oszczędność czasu [33].
