Inżynier i Fizyk Medyczny 4/2017 vol. 6
265
biomateriały
/
biomaterials
artykuł naukowy
/
scientific paper
bulion ma następujący skład:
S.aureus
(ATCC 25923),
S.aureus
(CIP106760),
Enterococcus faecalis
(ATCC 51299),
Staphylococcus
epidermidis
(ATCC12228). Wszystkie roztwory zostały rozcień-
czone w stężeniu od 0,03 do 2 mg/mL w pożywce agarowej
Müeller-Hinton. Bakterie inkubuje się w odpowiednich dla nich
warunkach przez 24 godziny. Następnie do kolejnych próbek
bulionu bakteryjnego wkrapla się antybiotyk o różnych koncen-
tracjach. Rozwój bakterii jest oceniany na podstawie pomiaru
absorbancji przez automatyczny czytnik.
Badanie strefy zahamowania
wzrostu bakterii [16, 21, 22]
Jest to podstawowe badanie bioaktywności cementu kostnego.
Przeprowadza się je poprzez umieszczenie próbki modyfikowa-
nego cementu kostnego w pożywce z bakteriami (np.
Staphy-
lococcus aureus
) po 24h ich inkubacji o początkowym stężeniu
bakterii ok. 1-2x10
8
CFU/ml. Następnie obserwuje się i mierzy
strefę zahamowania wzrostu bakterii. Badanie to opiera się
na normach NCCLS dotyczących wrażliwości na środki prze-
ciwdrobnoustrojowe. Przykładowe wyniki badań przedstawio-
no na rysunku 6.
Badanie cytotoksyczności [8, 10]
Badania cytotoksyczności mają na celu określenie wpływu
modyfikacji na organizm człowieka, a w szczególności wyklu-
czenie jej toksyczności. Do badań tych można wykorzystać ko-
mórki zwierzęce, np. komórki fibroblastów (3T3) lub komórki
osteoblastów (TMOb) myszy lub ludzkie, np. mezenchymalne
komórki macierzyste (hMSCs), komórki osteoblastów MG-63
lub Saos-2 czy komórki mięśniaka kostnopochodnego. Przy-
kładowe warunki hodowli: komórki namnażane w pożywce ho-
dowlanej α-MEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą
oraz 1% penicyliny (100 U ml
-1
) oraz siarczanem stryptomycyny
(100 mg ml
-1
). Komórki były hodowane w warunkach nawilżonej
atmosfery 95% powietrza z 5% dwutlenku węglu i temperatu-
rze 37
°
C. Pożywka była wymieniana co 2 dni. Urywki komórek
zostały oddzielone przy użyciu 0,25% trypsyny i dodane do świe-
żych pożywek hodowlanych o różnych gęstościach. Podstawo-
wa forma badania ma na celu sprawdzenie żywotności komórek
w obecności modyfikowanego cementu kostnego.
Badanie przylegania i proliferacji
komórek [8, 10, 23]
Zawiesina komórkowa o gęstości komórek 2 x 10
4
w dawce 1 ml
została ulokowana na specjalnej płytce do hodowli komórkowej.
Następnie położono na niej próbki cementu kostnego. Płytki
były przetrzymywane w atmosferze 95% powietrza oraz 5%
dwutlenku węgla i temperaturze 37
°
C. Po sześciu godzinach
dodano 1 ml roztworu MTT (tj. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide), następnie inkubowano przez
cztery godziny. Po tym czasie wylano roztwór. W celu rozpusz-
czenia soli formazanu dodano 1 ml roztworu DMSO (dimetylo-
sulfoksydu). Do kontroli zastosowano automatyczny czytnik do
badania wartości absorbancji. Dodatkowo komórki były spraw-
dzane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
Proliferację komórek oceniano w zawiesinie komórkowej
o gęstości komórek 5 x 10
3
w dawce 1 ml, ulokowanej na specjal-
nej płytce do hodowli komórkowej, przetrzymywanej w warun-
kach wilgotnej atmosfery (95% powietrza i 5% dwutlenku wę-
gla) i temperaturze 37
°
C. Na płytce położono próbki cementu
kostnego. Do oceny użyto roztworu MTT, który był podawany
po jednym dniu, następnie po czterech i siedmiu dniach w dawce
0,1 ml. Roztwór inkubowano do czasu uzyskania formy forma-
zanu, który następnie rozpuszczano roztworem DMSO. Do ba-
dania zastosowano automatyczny czytnik do badania gęstości
optycznej. W celu oceny wytwarzania nitkowych wiązań akty-
nowych cytoszkieletu komórek zastosowano skanujący lasero-
wy mikroskop konfokalny (Rys. 7). Po okresie inkubacji próbki
cementu kostnego przemywano roztworem soli fizjologicznej
i przetrzymywano przez 15 minut w 3,7% formaldehydzie. Na-
stępnie w celu permeabilityzacji dodano 0,1% roztwór soli fi-
zjologicznej z sufaktantem – Triton X-100 i odczekano kolejne
15 minut. Po trzykrotnym przemyciu solą fizjologiczną dodano
barwnik – Alexa Fluor 555 phalloidin na jedną godzinę. Po tym
czasie kolejny raz przemyto próbki, które dodatkowo zabarwio-
no przy wykorzystaniu roztworu DAPI (tj. 4’,6’-diamidino-2-phe-
nylindole) w celu ujawnienia jąder komórkowych (Rys. 7). Po
tych procedurach obserwowano komórki przy użyciu mikrosko-
pów (Rys. 7 i 8).
Rys. 6
Przykładowe wyniki badania strefy zahamowania wzrostu bakterii
Źródło: [12].
